磺胺类药物的检测方法！

　　据美国食品药品管理局消息，近日美国FDA更新进口预警措施(import alert)，其中，对我国8家企业的产品实施自动扣留，这8家企业的产品中，有2家都与磺胺类药物残留有关！
 

　　为什么水产品中会有磺胺类药物？
 

　　磺胺类药物(SAs，sulfonamides)属于化学合成抗菌药，具有抗菌谱广、疗效确定、方便安全的特点，是一类含有对氨基苯磺酰胺结构药物的总称。
 

　　磺胺药曾广泛应用于水产养殖中，在控制鱼病传染和感染方面起了很大作用，解决了不少水产养殖中存在的问题。对水产养殖中的细菌性竖鳞病、烂鳃病、弧菌病、疖疮、赤鳍病、肠炎、鞭毛虫病有良好的防治效果。
 

　　但是由于广泛应用也带来了许多新问题，如毒性反应、二重感染、细菌产生耐药性以及危害人体健康等不良后果，特别是在滥用的情况下更为严重。因此，各国普遍限制将此类药物用于肉食动物，并提出了严格的限量要求。
 

　　联合国食品法典委员会(CAC)和许多国家(包括中国)规定，水产品和饲料中磺胺类药物残留总量以及磺胺二甲基嘧啶的量不超过0.1mg/kg。
 

　　目前应用于磺胺药物残留的分析方法有高效液相色谱法、气相色谱法、液相-质谱联用法、ELISA法等。
 

　　为了使得该项检测更加方便快捷、精密度高，中检维康自主研发了《免疫亲和柱净化-高效液相色谱法测定水产品中16种磺胺残留物》的检测方法，该方法样品前处理步骤简单，杂质干扰很小，检测限低，并具有较好的回收率和精密度。

 

　　磺胺类药物检测方法
 

　　参考方法：
 

　　中华人民共和国国家质量监督检验检疫局SN/T4057-2014《出口动物源性食品中磺胺类药物残留量的测定 免疫亲和柱净化-HPLC和LC-MS/MS法》
 

　　材料  ——  1、仪器
 

　　1、高效液相色谱仪
 

　　2、紫外检测器
 

　　3、高速离心机
 

　　4、高速匀质器
 

　　5、泵流操作架
 

　　6、C-18柱(美国clover公司)
 

　　材料  ——  2、试剂
 

　　1、磺胺类药物标准品(中国兽药监察所)
 

　　2、Sepharose-4B(美国GE Healthcare)，
 

　　3、磺胺类药物免疫亲和柱(IAC-305北京中检维康技术有限公司)
 

　　材料  ——  3、溶液的配置
 

　　1、pH7.4 PBS溶液：8.0 克NaCl + 2.90克Na2HPO4 12H2O + 0.24 克 KH2PO4 + 0.2克KCl  加990mL纯水溶解，加纯水至1升。
 

　　2、1.1%乙酸0.01M PBS溶液(%)：3.58 Na2HPO4+1.56 NaH2PO4，加970mL纯水溶解，加11mL乙酸，加纯水至1升。
 

　　3、16种磺胺类药物储备液：分别称取5.0mg表1中的16种磺胺于50mL容量瓶中，用纯甲醇定容至50mL；每种磺胺药物的浓度为100ppm。
 

　　方法  ——   1、液相色谱条件
 

　　1、色谱柱：Cloversil-C18,4.6×250mm(5um)
 

　　2、流速：1.0mL/min
 

　　3、检测器：紫外检测器，波长270nm
 

　　4、进样体积：50~100uL
 

　　方法  ——   2、样品处理方法
 

　　1、准确称取匀浆后样品5.0 g，准确加入20.0mL 80%乙醇水溶液，高速匀质2min后，摇床震荡提取30 min，然后3000 RPM离心5min。
 

　　2、准确移取吸取上清液5.0 mL，用45.0mL纯水稀释并定容至50 mL，然后用玻璃微纤维滤纸过滤，收集滤液于干净烧杯中。
 

　　3、将上述滤液20.0 mL(0.5g样品)，以1滴/秒的流速全部通过磺胺类药物免疫亲和柱，直至空气流经亲合柱，随后用10.0mL纯水以1-2滴/秒的流速淋洗亲和柱，直至空气流经亲合柱。
 

　　4、将玻璃小管置于亲和柱下，用2.0 mL甲醇以1滴/秒淋洗亲和柱，将所有样品淋洗液收集于玻璃测试管中，50 °C下氮气浓缩吹干后用流动相定容至0.5 mL，供HPLC分析。
 

　　方法  ——   3、添加回收试验
 

　　对空白鱼肉，虾肉和蟹肉样品进行添加回收实验，分别添加20ug/kg、50ug/kg和100ug/kg三个浓度水平，每个浓度做5组平行实验，计算回收率和变异系数
 

　　结果与分析  ——   1、HPLC方法的建立
 

　　色谱条件的选择：
 

　　测定磺胺药物的反相HPLC流动相体系主要有：乙酸铵-乙腈/甲醇，磷酸盐缓冲液-乙腈/甲醇，乙酸-乙腈/甲醇等，经反复对比试验，本实验选择乙酸盐溶液-甲醇流动相体系，SAs在较短的时间内分离效果最好，且柱压较低。
 

　　SAs属两性化合物，因此通过简单地调节流动相的pH值能够改善分离和控制SAs的保留时间。试验表明，在pH6.5～2.5范围内，较低pH可明显增加对SAs的分离能力(个别SAs顺序可发生改变)，但保留时间延长。本试验选择1.1%乙酸0.01M PBS溶液-甲醇做流动相，并采取梯度洗脱的方式达到很好的效果，见图1，为16种磺胺类药物分别50ug/L的HPLC色谱图。
 

　　图1 16种磺胺类药物分别50ug/L的HPLC色谱图
 

　　结果与分析  ——   2、样品添加回收率
 

　　鱼肉，虾肉和蟹肉样品分别添加16种磺胺类药物20ug/kg、50 ug/kg和100 ug/kg三个浓度水平回收率结果：样品回收率在80%-106.5%之间，变异系数小于10%；
 

　　根据液相色谱灵敏度(10倍信噪比)和样品提取方法计算，该方法样品检测灵敏度为20ug/kg。鱼肉样品添加20ug/kg 16种磺胺液相色谱检测色谱图见图2。
 

　　鱼肉样品添加16种磺胺20ug/kg液相色谱检测色谱图

 

　　鱼肉样品中16种磺胺类药物加标回收率和精密度(n=5)

 

　　虾肉样品中16种磺胺类药物加标回收率和精密度(n=5)

 

　　蟹肉样品中16种磺胺类药物加标回收率和精密度(n=5)